6 étapes pour comparer les performances de deux mélanges réactionnels différents pour la PCR en temps réel

Guide d’évaluation des mélanges PCR en temps réel

Lors de l’évaluation d’un nouveau mélange réactionnel pour la PCR en temps réel, il est important d’examiner les bons paramètres. Ce guide fournit un protocole et des conseils sur la façon d’effectuer une évaluation rapide d’un mélange réactionnel de PCR en temps réel.

 

1. Préparer une série de dilution d’ADN

Préparer une série de dilutions d’ADN selon la figure ci-dessous. Mélanger bien en faisant tourner les tubes (ne pas vortexer !) et centrifuger.

*Employer la dilution précédente.

Pour l’ADN génomique, utiliser les tubes 1 à 4. Pour les autres types d’ADN, utiliser les tubes 1 à 6. La concentration initiale d’ADN est de 100 ng/µl. Les concentrations finales d’ADN dans chaque tube sont notées dans les cases au-dessus des tubes.

2. Préparer un mélange réactionnel

Préparer un mélange réactionnel selon le tableau ci-dessous. Après avoir ajouté tous les composants, agiter au vortex pendant 2 secondes et centrifuger.

Pour les sondes

3. Distribuer le mélange réactionnel

Distribuer 20 µl du mélange réactionnel dans le fond des puits bleus selon la figure ci-dessous.

4. Distribuer l’ADN

Distribuer 5 µl d’ADN de la série de dilution, dans les puits. S’assurer que la pointe est immergée le moins possible dans le liquide du tube et du puits. L’ADN doit être distribué dans le liquide et non sur les parois des puits.

NB : Ne pas pipeter de haut en bas dans les puits ; l’ADN se mélangera pendant le chauffage initial de la PCR.
Les numéros dans la figure ci-dessus correspondent aux numéros des tubes dans la série de dilution de l’étape 1. Ajouter de l’eau de qualité PCR dans les puits NTC (témoins sans matrice) au lieu de l’ADN.

5. Lancer la PCR

Utiliser le protocole des cycles PCR ci-dessous lors de la réalisation de la PCR en temps réel. Exécuter la courbe de fusion selon les paramètres par défaut de l’instrument.

Pour les sondes

Aucun réglage pour la courbe de fusion

6. Évaluer les résultats

Les résultats doivent être conformes aux spécifications énumérées ci-dessous afin d’accepter le mélange. Utilisez le tableau ci-dessous pour évaluer le mélange.

Pour les sondes

Pas de résultat pour la courbe de fusion.

Notes

Les résultats doivent être conformes aux spécifications indiquées pour que le mélange soit accepté. Noter que les paramètres : point de fusion et valeurs Cq, dépendent du tampon et ne peuvent ni ne doivent donner exactement les mêmes résultats que les expériences avec un tampon différent.Pour mieux comprendre ce qu’il faut rechercher lors de l’évaluation d’un mélange, veuillez lire les recommandations ci-dessous.

Courbe d’étalonnage

Lorsque l’on examine la courbe standard, les trois principaux paramètres à prendre en compte sont les suivants : L’efficacité de la PCR, la valeur R² et l’écart type entre les répétitions.

L’efficacité de la PCR indique l’efficacité avec laquelle la cible a été amplifiée et doit se situer entre 90 et 110 % pour être acceptable. C’est l’un des paramètres les plus importants à prendre en compte lors de l’évaluation d’un mélange.

La valeur R² est une mesure statistique de la proximité des données avec la ligne de régression et doit être ≥ 0,98.

L’écart-type entre les répétitions indique la précision du pipetage. L’écart-type doit être ≤ 0,2.

Courbe de fusion

En regardant la courbe de fusion, il doit y avoir un pic distinct à la température de fusion prévue du produit. Il est important de noter que la température de fusion dépend du pH et du tampon. Par conséquent, on ne peut pas s’attendre à ce que les produits de PCR provenant de deux mélanges différents aient exactement la même température de fusion. Une différence de quelques degrés dans la température de fusion n’est pas importante pour la performance du mélange.

Les témoins sans matrice (NTC) ne doivent pas avoir un pic à la même température de fusion que le produit prévu. Si c’est le cas, il y a alors une contamination, qui peut donner une fausse contribution aux résultats.

D’autres pics que les pics du produit prévu peuvent apparaître dans le tracé de la courbe de fusion et constituent une indication d’une amplification non spécifique. Tant que les pics sont vraiment petits ou tant que les puits NTC apparaissent sur le tracé de l’amplification ≥ 40 cycles ou ≥ 10 cycles après la plus faible concentration d’ADN, alors l’amplification non spécifique peut être négligée.

Valeur Cq

Les valeurs Cq (cycle de quantification) doivent être évaluées par rapport à l’efficacité de la PCR et ne doivent pas être le seul point d’interprétation, tant que l’efficacité de la PCR est calculée et maintenue dans les spécifications (90-110 %). Si la valeur Cq est extrêmement élevée, cela peut être dû à une faible efficacité de la PCR, et donc le problème peut être détecté dans l’évaluation de l’efficacité.

L’incohérence des valeurs de Cq peut également être due à la présence d’inhibiteurs dans l’échantillon et peut donner lieu à une efficacité supérieure à 110 %.

En outre, la valeur Cq peut être influencée par le niveau de SYBR, le niveau de ROX et la longueur de la cible (lors des expériences avec SYBR) et peut donc varier d’un mélange réactionnel à l’autre. De petites différences dans les valeurs Cq sont attendues lors de la comparaison de deux mélanges.

Niveau de SYBR

Il est moins pertinent d’examiner les niveaux de SYBR lors de l’évaluation d’un mélange réactionnel. Ce niveau peut être manipulé en ajoutant simplement plus de SYBR au tampon, et n’a pas nécessairement quelque chose à voir avec la performance du mélange. Une quantité excessive de SYBR peut inhiber l’amplification par PCR, mais si c’est un problème, il sera détecté lors de l’évaluation de l’efficacité de la PCR.

De plus, le niveau de SYBR peut être influencé par le ROX si la courbe d’amplification est tracée avec Rn ou ΔRn sur l’axe des ordonnées. Ce n’est que dans la vue multicomposant d’une amplification que le ROX n’influence pas la valeur Cq.

Comparaison de deux mélanges

Si deux mélanges réactionnels différents sont comparés, préparer un mélange réactionnel avec l’autre mélange réactionnel également et avec les mêmes concentrations d’amorces.

Si le même protocole de cycles PCR est utilisé, distribuer le mélange réactionnel et les dilutions d’ADN selon les étapes 3 et 4, mais dans les puits A7 à D12. Réaliser la courbe de fusion selon les paramètres par défaut de l’instrument.

Si l’autre mélange réactionnel est utilisé avec un protocole de cycles PCR différent, distribuer le mélange réactionnel et les dilutions d’ADN dans une deuxième plaque PCR conformément aux étapes 3 et 4. Tester les plaques séparément. Réaliser la courbe de fusion selon les paramètres par défaut de l’instrument.

Autres paramètres

Ce guide met l’accent sur la simplicité et la limitation du temps de travail nécessaire. Afin d’effectuer une évaluation approfondie d’un master mix, d’autres paramètres doivent être pris en compte. Les paramètres les plus importants sont les suivants

• La conception de l’amorce et de la sonde
• La température d’annealing
• La concentration des amorces et des sondes
• La concentration de l’échantillon
• Contamination par des inhibiteurs
• Choix des contrôles
• Réglage du seuil
• Chimie de fluorescence correcte

En examinant tous ces paramètres, il est possible de procéder à une évaluation approfondie et minutieuse et la configuration de l’expérience sera alors optimale.

 

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